Una PCR a tiempo real no es más que la monitorización de una PCR para poder determinar la cantidad de ADN que se produce en cada ciclo. Seguramente la PCR es la base de la biología molecular y la bioquímica actual; no se puede concebir ninguna técnica molecular moderna sin antes haber amplificado el ADN, y precisamente esto es lo que hace la PCR. La reacción en cadena de la polimerasa (“Polymerase Chain Reaction”) fue desarrollada por Kary Mullis en 1986, y por ello le otorgaron el premio Nobel de Química en 1993. La PCR permite amplificar de manera controlada fragmentos de ADN partiendo de una sola copia de ADN molde.
La PCR se fundamenta en las propiedades naturales para replicar las hebras de ADN que tienen las polimerasas, es decir, se aprovecha la capacidad de reparación y regeneración que tiene el ADN. El termociclador es el aparato indispensable para la realización de las PCRs. Estos equipos son capaces de realizar los ciclos de temperaturas necesarios para la correcta amplificación del ADN: pueden calentar o enfriar las muestras de manera rápida y precisa durante los ciclos deseados. Los reactivos necesarios para hacer una PCR son:
- ADN molde: va a ser la base sobre la que se amplifica, y debe ser de buena calidad, con una concentración entre 2 y 20 ng/ul
- Cebadores: una pareja de cebadores complementaria cada uno de ellos a una de las dos cadenas del ADN molde. La distancia entre los dos no debe ser superior a las 5000 bases.
- Nucleótidos (dNTPs): van a ser la materia primera con la se va a copiar las nuevas cadenas.
- Taq polimerasa: es la enzima encargada de reparar las cadenas.
- Buffers: es el encargado de proporcionar a la polimerasa un medio óptimo de trabajo.
Desnaturalización
Calentando el ADN hasta los 94-96 ºC se consigue separar las dos hebras del ADN. Este proceso se llama desnaturalización y consiste en romper los puentes de hidrógeno para separar las cadenas de ADN y dejarlas en cadenas sencillas.
Alineamiento
Llevando la temperatura de la muestra hasta los 55-65 ºC se consigue que los cebadores (primers en inglés) se unan a su secuencia complementaria de la cadena molde. Los cebadores son fragmentos de ADN sintetizados artificialmente y diseñados para que se peguen a una región concreta conocida previamente. Además, se sabe que las citocinas se unen a las guaninas, mientras que las adeninas lo hacen con las timinas.
Partiendo de esta idea se puede diseñar un fragmento homólogo al inicio de la región que se quiere amplificar. Con tan solo 20 o 25 bases se puede diseñar un fragmento (cebador) que sea específico y solo se pegue a la región de interés. Dependiendo de la cantidad de G y C el fragmento tendrá una temperatura concreta de alineamiento (temperatura de anealing), y será esta temperatura la que se pone en el termociclador durante la fase de alineamiento.
Extensión
En la tercera fase del proceso es dónde entra en juego la polimerasa. La polimerasa es una enzima que sintetiza una nueva hebra de ADN partiendo del ADN molde. Es decir, partiendo la cadena sencilla, y a partir de la unión del cebador es capaz de generar la hebra de ADN complementaria al molde. Así, al final de la extensión se tienen dos cadenas de ADN de doble hebra cada una.
La polimerasa funciona a una temperatura de 72 °C, por lo que se debe programar el termociclador a esta temperatura para que la extensión o elongación funcione. Si se repiten estos tres pasos, en 25 o 40 ciclos se obtiene un número de copias de ADN muy grande, ya que el aumento en cada ciclo es exponencial. A los 30 ciclos de PCR el número de copias de ADN generado es ya superior al millón de cadenas. Esto genera una concentración de ADN suficiente para realizar la mayoría de los análisis moleculares en el laboratorio.
Real-time PCR o qPCR
La real-time PCR o PCR cuantitativa es una variante de la PCR convencional que permite monitorizar qué pasa en cada uno de los ciclos de la amplificación; esto permite realizar múltiples aplicaciones. Al preparar la reacción se añade un fluorocromo, el cual emite luz, y la cantidad de luz que emite es proporcional a la cantidad de ADN que se produce. La reacción tiene lugar en un termociclador a tiempo real que está dotado de una cámara capaz de captar la fluorescencia que emite la reacción.
Así se puede establecer una relación entre la concentración de ADN presente y la intensidad de luz. Lo que permite cuantificar absoluta o relativamente al ADN de partida. A mayor concentración inicial se obtiene mayor fluorescencia, y se entra antes en la fase exponencial de la PCR, que es donde se mide la fluorescencia. El umbral de detección se establece al inicio de la fase exponencial de la amplificación, de este modo aumenta la sensibilidad de la técnica.
Protocolos básicos usados
Tipos de marcajes y fluorocromos
Para el marcaje con fluorocromos en las qPCRs se puede diferencias dos grandes bloques:
SYBR Green
El SYBR green es un compuesto orgánico que actúa de forma parecida a un agente intercalante La molécula de SYBR green se introduce en la estructura secundaria de la doble hélice del ADN. La unión a la doble hélice es muy fuerte, generado una estructura secundaria llamada FRET, y que presenta un pico de absorción a 498 nm junto a un pico de emisión a 522 nm.
Pros y contras del SYBR Green
- Pros: al no ser una unión específica permite determinar distintos fragmentos de interés con el mismo flourocromo, solo es necesario diseñar distintos pares de cebadores para detectar distintas regiones. Esto permite que la detección sea más económica que otros métodos.
- Contras: al unirse a cualquier fragmento de ADN que esté en doble cadena puede generar fluorescencia de otros fragmentos a los de interés. Para evitar esto hay que optimizar las temperaturas de la PCR y verificar que únicamente se genera un producto de PCR mediante la realización de una curva de disociación. No se puede multiplexar distintas reacciones, ya que todas irían marcadas con el mismo fluorocromo y no sería posible diferenciar cuál es cuál.
Sondas
Las sondas son pequeños fragmentos de ADN sintetizados artificialmente y complementarios a la región de interés. Estas sondas tienen una temperatura de unión similar a los cebadores, de modo que se unen al mismo tiempo que ellos. Las sondas están unidas a dos fluorocromos; uno que emite fluorescencia (Reporter) y el otro que la apantalla (Quencher) de modo que mientras la sonda permanece integra, no emite luz. Durante la fase de extensión, la polimerasa rehace la cadena complementaria y rompe la sonda, separando los fluorocromos y generando luz. Existen distintos tipos de sonda en función del fabricante, siendo las sondas TaqMan© las más comunes.
Genética aplicada en salud
El estudio de la cadena genética en el ser humano ha tenido un gran impacto positivo en el alcance de las diferentes tecnologías en salud y bienestar. De esta manera se han construido diferentes técnicas y metodologías que permiten avanzar en gran medida en el tratamiento de algunas afecciones. Por esta razón, se hace necesario que el profesional tenga el conocimiento y la información necesaria para ejecutar planes de acción, respondiendo de manera adecuada a estas diversas situaciones.
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