El desarrollo científico es el pilar para el éxito del sector médico. Por este motivo, es fundamental conocer las nuevas tecnologías que rodean la práctica laboral. En este texto ahondaremos en los avances del sector de la oncología digestiva, en concreto veremos los adelantos con relación a las técnicas NGS, sus usos potenciales y las limitaciones que presenta en la actualidad.
El objetivo de este texto es proporcionar a los interesados en la rama gastroenterológica conocimientos actualizados, los cuales los orienten durante los retos y exigencia de la praxis laboral.
Contexto
El cáncer puede verse como una enfermedad genética en tanto es debido a la acumulación de mutaciones en la secuencia de ADN de genes que controlan la correcta proliferación, diferenciación y muerte celular. Así la oncología clínica se ha beneficiado de la incorporación de numerosos marcadores diagnósticos, pronósticos y predictivos basados en el estudio de la secuencia ADN y sus alteraciones.
La secuenciación del ADN y con ello las aplicaciones de la misma, se han visto revolucionadas en los últimos años por la aparición de la secuenciación masiva paralela o secuenciación de última generación (NGS, del inglés Next Generation Sequencing), que permite obtener la secuencia de millones de moléculas de ADN en un único ensayo, pudiendo así estudiar más genes, procesar más muestras, haciéndolo además a un coste mucho menor.
Antecedentes
La principal técnica de secuenciación de ADN anterior a la NGS es el método de terminación de cadena de Sanger o método didesoxi. Publicado en el año 1979 por Fred Sanger y colaboradores5 , utiliza unos análogos químicos de los cuatro nucleótidos denominados didesoxinucleotidos. Por otro lado, a mediados de la década de los 80, Kary Mullis y colaboradores mejoran la reacción en cadena de la polimerasa (PCR por sus siglas en inglés polymerase chain reaction), técnica angular de la biología molecular que permite amplificar regiones de ADN de interés.
La combinación de estos dos métodos, junto con mejoras técnicas como el uso de didesoxinucleotidos marcados con fluorescencia y la electroforesis capilar automatizada, hacen que la secuenciación Sanger siga siendo en la actualidad la técnica de referencia, el gold standard, en la obtención de secuencias de ADN
Problemas en la aplicación de la secuenciación sanger en oncología
La secuenciación Sanger presenta una sensibilidad reducida en la detección de variantes de secuencia con frecuencias alélicas menores al 15%. Este podría ser un problema en su aplicación en oncología molecular. Los tumores no sólo están formados por células tumorales, si no que presentan otros tipos celulares no tumorales como células del estroma o del sistema inmune infiltradas.
En una extracción de ADN de tumor, el ADN de célula tumoral suele estar diluido con ADN de células sanas. Por otro lado, la secuenciación Sanger no es aplicable a fragmentos de ADN demasiado cortos y requiere un ADN de una calidad aceptable. La muestra de material tumoral típica FFPE (del inglés formalin fixed paraffin embedded), suele tener fragmentos de ADN degradados, cortos y de mala calidad.
De este modo el genotipado de las muestras tumorales se realiza normalmente mediante técnicas compatibles con el material FFPE y con la alta sensibilidad, como por ejemplo la PCR en tiempo real con sondas específicas que reconoce mutaciones específicas. Estos métodos no muestran directamente la secuencia de ADN, pero permiten saber si está presente una determinada variante con alta sensibilidad y especificidad.
Nuevas técnicas de secuenciación
La secuenciación Sanger, junto con otros métodos como la pirosecuenciacion, se consideran secuenciación de primera generación. Entre ellos comparten, a grandes rasgos, que se obtiene la secuencia nucleotídica a partir de una población de moléculas de ADN en solución, que son amplificadas mediante técnicas de PCR, con los sesgos y problemas que esto puede suponer.
La secuenciación NGS se considera de segunda generación, ya que, al incorporar importantes mejoras tecnológicas en nanotecnología, microfluídica y sensores de alta sensibilidad, permite la amplificación por PCR en soporte sólido de moléculas de ADN individuales. Estas moléculas amplificadas, cientos de miles o millones, son posteriormente secuenciadas a la vez, en paralelo, en una única reacción, motivo por el cual estas técnicas también se denominan secuenciación masiva paralela.
Dentro de la NGS de segunda generación existen otras tecnologías como SOLID, Complete Genomics, DNA nanoball o GeneReader. Existen además métodos NGS de tercera generación de secuenciación directa de molécula única y lectura larga, como las tecnologías de Pacific Bioscience, Helicos o Nanopore. Estos desarrollos todavía no se han incorporado a los laboratorios clínicos, pero quizás en los próximos años se vuelva a revolucionar el campo de la secuenciación reduciendo aún más el coste por base secuenciada y los tiempos de ensayo.
Ventajas del uso de la NGS en la oncología digestiva
La posibilidad de obtener millones de secuencias en un único ensayo permite estudiar más muestras, más genes o asignar más secuencias a regiones de interés para las que se quiera tener mayor sensibilidad.
El coste por base secuenciada es mucho menor, no solo por el precio de los reactivos, si no por el menor tiempo dedicado por el personal de laboratorio. El tiempo global dedicado a la técnica puede ser de varios días, más que cualquier ensayo de determinación puntual, sin embargo, menos de lo que se dedicaría a varios ensayos puntuales realizados en serie.
Por otro lado, la cantidad de muestra biológica necesaria es muy poca y su calidad no ha de ser óptima, siendo compatible con muestras reducidas como aspiraciones con aguja fina o difíciles como la muestra tumoral típica FFPE.
Limitaciones de la NGS en la práctica clínica
A pesar de su gran potencial han de tenerse en cuenta una serie de limitaciones y precauciones en la aplicación de estas técnicas en la práctica clínica. Primero, la gran cantidad de información puede generar problemas en la obtención y selección de aquella clínicamente útil. Además, al ser posible estudiar regiones de interés y genes al completo, es previsible la identificación de un número mayor de variantes de significado incierto en genes conocidos, de modo que puede aumentar la incertidumbre diagnostica.
Por otro lado, en el uso de paneles de genes de gran tamaño, exomas o genomas, podrían identificarse variantes o mutaciones patogénicas fuera de las regiones de interés y del objetivo original por el que fue solicitado el estudio, como por ejemplo mutaciones de susceptibilidad genética a enfermedades que el paciente no se ha planteado conocer. Son los llamados hallazgos incidentales y en estudios de línea germinal pueden suponen un conflicto en lo que se refiere a la autonomía del paciente, de modo que este extremo ha de contemplarse y quedar recogido en el consentimiento informado a firmar por el paciente previo al estudio.
La actualización profesional en la oncología digestiva
Como hemos visto a lo largo del texto, la utilización de NGS es una excelente herramienta en el ámbito clínico, por lo cual cualificarse en las innovaciones tecnológicas es un requerimiento si se desea destacar en el mercado profesional actual. En TECH Universidad Tecnológica entendemos a la perfección los requerimientos actuales, por lo cual ofrecemos el Máster en Oncología Digestiva como una excelente oportunidad de crecer a nivel médico.
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