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La secuencia del ADN humano apareció recién a inicios de siglo, en el 2001, con el Proyecto del Genoma Humano en el que fue publicado el borrador de la secuencia del genoma. Este hito fue posible gracias a los avances científicos en la secuenciación de ADN, una de las principales técnicas en biología molecular junto con el FISH, el PCR o la extracción de ácidos nucleicos. Gracias a herramientas como estas hemos podido entender mejor patologías complejas como el cáncer. A partir de ese descubrimiento, el panorama del diagnóstico molecular ha estado cambiando de una forma muy acelerada. Antes, en la era pregenómica el diagnóstico estaba centrado principalmente en las condiciones causadas por las mutaciones de genes únicos, con lo que se requería la detección de solo una o un puñado de mutaciones.
Avances en la secuenciación del ADN
La secuenciación del ADN engloba todos los métodos que conducen a establecer el orden en que los nucleótidos se encuentran en un fragmento de ADN. La introducción de métodos rápidos de secuenciación a finales de los años 70 representó un cambio importante en los estudios sobre el ADN.
Existen varios métodos de secuenciación de los ácidos nucleicos. Los dos más clásicos son el de Maxam y Gilbert, quienes utilizan reactivos químicos a fin de cortar el ADN a nivel de bases específicas, y el denominado enzimático de terminación en cadena o didesoxi (Sanger, Nicklen y Coulson). El fin de ambos es conseguir la secuencia completa de cada una de las bases que constituyen un fragmento de ácido nucleico. El método enzimático de terminación en cadena es el más utilizado en la actualidad. Para describirlo hay que ver primero cuáles son sus componentes.
Componentes del método enzimático de terminación en cadena
Para realizar esta técnica se preparan cuatro tubos que contienen como componentes comunes:
- El ADN molde de cadena sencilla que se quiere secuenciar.
- Un cebador o ‘primer’ que va a servir para el inicio de la síntesis del ADN que se va a secuenciar. Es importante recordar que las enzimas polimerasas, casi todas, necesitan para comenzar su reacción.
- Un cebador marcado fluorescente, quimioluminiscente o radiactivamente
- Una polimerasa que se va a encargar de copiar la cadena molde del ADN a secuenciar.
- Cuatro nucleótidos (dATP, dCTP, dGTP y dTTP) que podrían ser marcados alternativamente al ‘primer’.
Como componentes específicos se añade a cada uno de los cuatro tubos una baja concentración de un didesoxinucleótido (ddATP o ddCTP o ddGTP o ddTTP). El dideóxido es un nucleótido trifosfato que, por carecer de grupos OH tanto en el carbono 2 ́como el 3́ de la ribosa, imposibilita el crecimiento de la cadena y paraliza la síntesis. Existe la variante de secuenciación automática en la que se realiza una “secuenciación por terminador fluorescente”. Allí, en lugar de marcar los cebadores o primers, se ha marcado cada uno de los cuatro didesoxinucleótidos. La ventaja de esta variante es que la secuenciación se puede llevar a cabo en una sola reacción.
Electroforesis capilar
Los sistemas de detección se basan en el tamaño de los fragmentos de ADN. Hoy día, esta detección se realiza mediante electroforesis capilar, que es mucho más rápida y el operario no tiene que manipular directamente la acrilamida (no hay que preparar gel). La detección se lleva a cabo gracias a que los fluorocromos, con los que se ha marcado cada uno de los didesoxinucleótidos, emiten con distintas longitudes de onda. El coste por secuencia es menor que con geles de acrilamida, aunque hay que realizar una elevada inversión en el equipo. Su inconveniente es que el tamaño de las lecturas obtenidas es de unas 500 bases con 99% de precisión por lo que, a partir de 1000 nucleótidos, resolver en una electroforesis capilar un solo nucleótido de diferencia resulta difícil.
Esta limitación ha sido abordada de distintas maneras: una de ellas es la llamada «shotgun», la cual consiste en cortar la gran molécula de ADN con enzimas de restricción y fuerzas mecánicas, posteriormente, clonar el ADN fragmentado en un vector de ADN (cromosoma artificial bacteriano o BAC) y amplificarlo en una bacteria como la escherichia coli. Luego, se purifica el ADN obtenido de la amplificación en la bacteria, se secuencian estos fragmentos cortos y se ensamblan computacionalmente mediante la identificación de las secuencias que se solapan. Los intervalos entre las secuencias ensambladas se pueden rellenar mediante lo que se conoce como paseo de cebadores, subclonado, etc.
NGS
La secuenciación que existía desde los años setenta no era capaz de afrontar la secuenciación de grandes partes del genoma, pero fue evolucionando. Se hacían máquinas cada vez más grandes, que podían procesar 96 muestras en paralelo y dar una información de 1 Mb al día. En 2007, apareció la NGS (Next Generation sequencing o secuenciación de nueva generación) y bajaron muchísimo los precios. También, hay que diferenciar entre el ensamblaje de novo de un genoma, que es lo que se hizo en la secuenciación del genoma humano, y la resecuenciación, que es lo que se hace hoy en día con las técnicas NGS de segunda generación. Actualmente, se utilizan tecnologías de segunda y tercera generación. La primera generación de la secuenciación era la que se ha explicado en el anterior apartado y no era masiva, ni factible para grandes genomas.
Previa a la secuenciación por NGS hay que hacer una preparación de librería, la cual consiste en dar a la secuencia problema una estructura y crear unas secuencias de apoyo para que la máquina la pueda leer. En este paso hay que fragmentar el ADN y reparar los extremos, y en las técnicas de segunda generación hay que hacer una amplificación clonal en soporte sólido. Las máquinas de segunda generación no tienen la capacidad de leer una sola molécula, por eso hay que hacer el paso de amplificación. Después de esto, se deposita la librería amplificada sobre la superficie con la que se va a leer. Se pone la librería sobre una especie de microcámara microfluídica que permite la entrada y salida de reactivos en un volumen muy pequeño.
Las dos tecnologías más comunes para la fragmentación del ADN son la sonicación (física) y la tagmentación (enzimática con transposasas). En la tagmentación las transposasas cortan y ya empalman los adaptadores. En el proceso de creación de las librerías es imprescindible el control de calidad de la muestra.
Amplificación clonal
Después de la preparación de las librerías se continúa con la amplificación clonal, que en la segunda generación de NGS se da en una superficie sólida y se puede hacer de dos maneras, según las principales casas comerciales existentes hoy día:
- Ion Torrent: La amplificación clonal se hace sobre la superficie de una bolita con oligos. Se hacen microreacciones en emulsiones de aceite en agua. Cada molécula captura una de las moléculas de la librería y la amplifica, de manera que la bolita queda recubierta de miles de copias de la molécula original.
- Illumina: La amplificación se da sobre la misma superficie en la que se va a llevar a cabo la secuenciación. Es lo que se llama una PCR en puente. Los oligonucleótidos complementarios a los dos adaptadores están pegados a la superficie y el ADN sintetizado se va doblando, haciendo puentes entre los adaptadores. Al final, se obtiene una amplificación en forma de clon o clúster.
Para la lectura, el secuenciador más extendido es de Illumina. Se parte de los clones amplificados sobre la superficie de lectura y se aplica la tecnología de total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy, que es capaz de identificar la incorporación de fluorocromos en los clústeres. Se van haciendo ciclos de adición de nucleótidos, cada vez se ponen los cuatro dNTPs, marcados con fluorocromos diferentes. El microscopio mira en cada ciclo qué color hay en cada cluster. En estos nucleótidos que se añaden, el extremo 3’ está bloqueado, eliminando así la posibilidad de error de homopolímero. Este bloqueo es reversible. Entre ciclo y ciclo se añade el reactivo TCEP, que desbloquea el extremo 3’ para que se pueda seguir con la lectura.
Se pueden leer 75 pb desde un extremo y 300 pb desde ambos extremos. Cuanto más se quiera leer, más tarda porque son ciclos aditivos. Si se quieren leer 300 pb se tarda unas 56 horas. Actualmente, no se secuencian genomas enteros: lo máximo que se hace es el exoma, que en total es un 2 % del genoma. Para secuenciar solo la parte que más interesa del genoma, se tiene que hacer una captura o enriquecimiento (target enrichment) de esa zona, para ello se han desarrollado muchas tecnologías, aunque hoy en día hay dos que son las más extendidas: Targent enrichment por captura por hibridación (mediante sondas), y Targent enrichment por captura por amplicones (PCR multiplexadas). En ambos casos hay regiones de cobertura que se capturan mejor que otras.
Importancia para la patología
Como hemos visto, los métodos para secuenciar el ADN han avanzado rápidamente en los años posteriores a la publicación del genoma humano. No obstante, todavía tienen muchas limitaciones, ya que no hay un método adecuado para la detección de ciertos tipos específicos de mutaciones. Con todo, estas herramientas han sido fundamentales para comprender mejor la estructura molecular del cáncer
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