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Para empezar a hablar de las técnicas proteómicas lo primero que se debe tener claro es que van muy de la mano de la genómica. Ambas han evolucionado a la par, por eso para poder entender la proteómica hay que explicarlas conjuntamente. La genómica es un conjunto de ciencias y técnicas dedicadas al estudio integral del funcionamiento, contenido, evolución y origen de los genomas.
Para ello utiliza el concurso de otras ciencias, (biología molecular, bioquímica, informática, estadística). Esta evolución se ha podido hacer gracias a la aportación de los avances en secuenciación de ácidos nucleicos, bioinformática, y al conocimiento de los genomas completos de algunos microorganismos. Su objetivo es predecir la función de los genes a partir de su secuencia o de sus interacciones con otros genes. Por tanto, no tiene un enfoque reduccionista como la biología molecular o la bioquímica, sino que estudia los problemas de manera global y de forma interdisciplinaria.
Genómica en microbiología
- Se inicia a partir de la secuenciación del primer genoma completo de un microorganismo (Haemophlus influenzae) en 1995.
- En el 2000 había secuenciadas trece especies bacterianas, en el 2002 sesenta, y en el 2004 ochenta y siete.
- Los datos que se van teniendo permiten avanzar en el diseño de vacunas y antimicrobianos. Asimismo, ha contribuido en el abordaje de enfermedades virales emergentes, y en la epidemiología.
Relación entre la genómica y la proteómica
Dicho todo esto ¿cómo se relaciona la genómica con la proteómica? Para ello primero una pregunta: ¿Qué es la información biológica? Se tienen tres niveles de información biológica:
- El genoma consistente en la información genética común en todas las células del organismo.
- El transcriptoma es la parte del genoma que se expresa en una célula en una parte específica de su desarrollo.
- El proteoma consistente en las proteínas que interactúan para dar a la célula su carácter individual.
Del genoma estático, al proteoma que es dinámico y múltiple. Hay unos factores decisivos que condicionan la aparición de la proteómica:
- La secuenciación de genomas a gran escala y el desarrollo de bases de datos de proteínas.
- El desarrollo de técnicas de espectrofotometría de masas para analizar proteínas y péptidos.
- Los avances realizados para la separación de proteínas mediante electroforesis bidimensional (2DPAGE) con la introducción de los gradientes de pH inmovilizados (IPSs).
Al igual que la genómica, la proteómica requiere la implicación de distintas disciplinas: Biología molecular, Bioquímica, Microbiología, Bioinformática. La Bioinformática es de gran importancia, ya que se necesitan ordenadores de gran capacidad para organizar la gran cantidad de información generada en estas investigaciones. Por tanto, la proteómica consiste en el estudio a gran escala de las proteínas, en particular de su estructura y función.
- El término fue acuñado en 1997 como analogía con la genómica, y la palabra proteoma fue acuñada por Marc Wilkins en 1994. El proteoma es el conjunto de proteínas codificadas por un genoma, una célula, un tejido.
- Permite tener una imagen dinámica de todas las proteínas expresadas en un momento dado y bajo condiciones concretas de tiempo y ambiente.
- Las proteínas, y no los genes, son las responsables de los fenotipos de las células.
Separación de proteínas
La tecnología más utilizada para la separación y aislamiento de proteínas es la electroforesis en geles de poliacrilamida (PAGE), que se pueden diferenciar en dos tipos:
- Monodimensional (SDS-PAGE).
- Bidimensional /2D-PAGE).
Para muchas aplicaciones proteómicas la SDSPAGE es el método de elección para resolver mezclas de proteínas.
- Las proteínas se separan de acuerdo a su masa y se solubilizan con dodecil sulfato sódico (SDS).
- Es una técnica sencilla y reproducible que permite la separación de proteínas de 10 a 300 kDa (KiloDaltons).
- La separación de proteínas 2D-SDS-PAGE es el método más eficiente para la separación de mezclas muy complejas de proteínas, permitiéndonos separar miles de proteínas en un único experimento.
- Se basa en una separación de las proteínas en función de la carga neta, seguida de una separación en función de su masa molecular.
- Su alta resolución se debe a que las dos separaciones se basan en parámetros diferentes.
- La separación de la primera dimensión se realiza mediante isoelectroenfoque, donde las proteínas se separan en un gradiente de pH hasta alcanzar una posición en la que su carga neta es cero (punto isoeléctrico).
- En la segunda dimensión las proteínas se separan mediante SDS-PAGE. Esto permite separar las 4.000-5.000 proteínas que hay en una célula.
- En ese sentido la tecnología ha mejorado mediante el desarrollo de geles con un gradiente de pH inmovilizado (IPG immobilized pH gradient).
- En estos geles el gradiente de pH se genera mediante las inmovilinas, estando copolimerizado con la matriz de acrilamida.
- Los geles IPG permiten mejorar la resolución, la capacidad, y aumentan la cantidad de proteínas cargadas.
- Tiene una gran reproducibilidad facilitando el cambio de información entre distintos laboratorios.
Identificación de proteínas
Ahora que se ha hablado de separar proteínas ¿cómo se identifican? Básicamente, hay dos opciones:
- La secuenciación de proteínas mediante la degradación de Edman (con sus limitaciones).
- La técnica MALDI-TOF4 , que consiste en disparar en vacío un láser sobre la bacteria disgregando las proteínas, de forma que el aparato (un espectrofotómetro de masas) traduce el tiempo de vuelo de esas proteínas en masa, de manera que aunque su estructura y carga sea la misma, su peso es distinto. El espectro de masas obtenido se compara con la información almacenada en las bases de datos de espectros conocidos.
Aplicaciones de la proteómica
Mediante el uso de las técnicas anteriormente descritas se puede:
- Identificar nuevos biomarcadores para el diagnóstico de enfermedades infecciosas.
- Identificar nuevos fármacos, determinar proteínas involucradas en la patogenia de enfermedades y en el análisis de procesos de transducción de señales, y aplicarlas a la medicina personalizada.
Todo ello se puede hacer mediante el diseño de microarrays de proteínas y anticuerpos para su utilización a gran escala, el estudio de mezclas complejas con un planteamiento distinto a la electroforesis 2D seguida de espectrofotometría de masas, que puede permitir secuenciar las proteínas, y su posterior análisis bioinformático. Como ejemplo se tiene la falta de expresión de las toxinas de Clostridium difficile cuando la bacteria es portadora del gen, ¿por qué no se expresa? ¿En qué circunstancias se expresa?.
Es por causas ambientales, por la presencia o ausencia de otra proteína producida por el huésped. ¿Se puede predecir que pacientes portadores del gen y en que circunstancias producen la toxina? La espectroscopia de masas en su variante MALDI-TOF5 se ha hecho popular permitiéndonos, actualmente, la identificación de bacterias y hongos, y posiblemente en un futuro próximo la determinación potencial de sensibilidad a antimicrobianos, aplicaciones en epidemiología, y la determinación de factores de virulencia, como el Panton-Valentine.
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