La extracción de ADN es el punto de partida de todos los análisis en biología molecular. Antes de empezar, hay que recordar que el ADN es el ácido nucleico que contiene las instrucciones genéticas usadas en el desarrollo y funcionamiento de todos organismos vivos, y se transmite de forma hereditaria de padres a hijos. Se sabe que el ADN se encuentra dentro del núcleo de las células, concretamente se encuentra empaquetado y organizado en los cromosomas. Cada célula contiene 46 cromosomas agrupados en 23 pares. Cada progenitor aporta un gameto (óvulo o espermatozoide) con una mitad de cada pareja de cromosomas.
Para aislar el ADN presente dentro del núcleo celular se debe romper la membrana plasmática y la envoltura nuclear. Este proceso se denomina lisado y, posteriormente, al lisado basta con hacer una purificación que consiste en separar los ácidos nucleicos de los demás componentes. Se utilizan disolventes como una combinación de fenol y cloroformo para eliminar las proteínas y los restos de la célula, y para quedar con el ADN se suele realizar una precipitación con isopropanol o etanol. A grandes rasgos, este es el primer paso que permite obtener ADN limpio para el posterior estudio en el laboratorio.
¿A partir de qué muestras se puede extraer ADN?
Las técnicas de extracción permiten conseguir ADN de calidad a partir de prácticamente cualquier material biológico, ya sea un tejido, un fluido, restos anatómicos, dientes o huesos. De todos modos, hay que tener en cuenta que cada soporte es diferente y puede requerir modificaciones o protocolos especiales. Esto es especialmente importante en la genética forense, donde a menudo las muestras de partida son de mala calidad, están contaminadas o deterioradas por el paso de los años. Para muestras actuales existen infinidad de métodos de extracción de ADN, tanto caseros como comerciales, y todos ellos funcionan perfectamente.
Lo más relevante es elegir bien el tipo de kit que se utiliza en función del material biológico inicial para así sacar la máxima cantidad de ADN posible. Esto permite trabajar con muestras de sangre, saliva, o cualquier tejido de manera fácil y rápida. Desde los años 50 se han diseñado distintos protocolos con la finalidad de obtener un ADN de calidad, así como garantizar la eliminación de inhibidores potenciales que dificulten el tratamiento posterior de la molécula.
Los métodos tradicionales, desarrollados durante la segunda mitad del siglo XX, usan solventes orgánicos para separar a las proteínas del ADN y, una vez suspendido en la fase acuosa, aislarlo por precipitación con etanol. Estos métodos pueden tardar desde unas horas hasta varios días y requieren preparar soluciones en el laboratorio. En general, los protocolos tradicionales consisten en cinco etapas principales:
- Homogeneización del tejido (en caso de que sea necesario)
- Lisis celular
- Separación de proteínas y lípidos
- Precipitación
- Resuspensión del ADN
A finales del siglo XX se introdujeron al mercado kits de extracción que utilizan matrices inorgánicas cargadas positivamente capaces de retener varios microgramos de ADN y separarlos del resto de las biomoléculas, permitiendo obtener un extracto libre de inhibidores.
Protocolo de trabajo para extracción mediante membrana
En el caso de los kits de extracción, que funcionan mediante bolas magnéticas, el mecanismo es el mismo, pero el ADN cargado negativamente se une a estas bolas magnéticas que se pueden separar del resto de componentes mediante el efecto de un imán. Esta unión ADN – bolas magnéticas también es reversible, de modo que finalmente se puede eluir el ADN en la solución deseada y dejar las bolas magnéticas pegadas al imán. Con estos kits se reduce considerablemente el tiempo de extracción de ADN y permiten procesar muchas muestras al mismo tiempo.
Protocolo de trabajo para extracción con bolas magnéticas
La selección del método de extracción es un paso fundamental en las técnicas moleculares y depende del organismo bajo estudio, el tejido disponible y su estado de conservación, la técnica que se aplicará posteriormente, así como la infraestructura de los laboratorios, los recursos económicos y tiempo para obtener resultados. Este módulo se centrará en la obtención de ADN de calidad a partir de muestras actuales, muestras que se pueden conseguir en cualquier consulta, hospital o laboratorio. Entonces se puede diferenciar entre dos grupos de técnicas para la obtención del material de partida para la extracción del ADN. Estos dos grupos son:
- Técnicas invasivas (sangre, tejido)
- Técnicas no invasivas (saliva, frotis bucal, heces)
A continuación, se verán los distintos métodos de extracción de ADN en función del material de partida que se dispone.
Invasivas
Históricamente, se ha utilizado la sangre como fuente de ADN. Esto se debe a que se encuentra ADN en los leucocitos (glóbulos blancos), pero no está presente ni en eritrocitos ni hematíes. No obstante, la sangre es un fluido con el que se trabaja habitualmente en todos los laboratorios del mundo para determinar infinidad de parámetros con lo que se puede extraer ADN sin necesidad de cambiar rutinas en el laboratorio.
Sencillamente, a la hora de sacar sangre de un paciente para un posterior análisis genético hay que respetar la proporción entre muestra y anticoagulante, y homogeneizar la muestra para evitar hemólisis y/o coagulación. Una vez obtenida la muestra hay que evitar movimientos bruscos durante su manipulación y transporte y deben conservarse en frío. Las etapas por las que debe pasar la muestra durante la extracción del ADN son:
Homogeneización
La homogeneización, mecánica o química, consiste en romper las uniones entre las células. Esto para aumentar la superficie de contacto y así facilitar la interacción con las soluciones de lisis que ayudan a liberar el material genético.
Lisis celular
Durante el proceso de lisis, las interacciones entre las moléculas que conforman la pared, la membrana celular y nuclear se modifican o destruyen permitiendo que los ácidos nucleicos se liberen. Se utilizan soluciones básicas, detergentes o agentes caotrópicos que permiten disolver la membrana celular, así como inhibidores para inactivar las enzimas que degradan el ADN. Los componentes celulares no solubles, como el material fibroso y proteínas que permanecen en solución, se separan del ADN por centrifugación; tanto la homogeneización como la lisis celular son similares en los protocolos tradicionales y comerciales.
Separación de proteínas y lípidos
En esta etapa se separa el ADN de las proteínas y lípidos mediante solventes orgánicos y ciclos de centrifugación o bolas magnéticas. Se utiliza la fuerte tendencia hidrofílica de los grupos fosfato para separarlos en medios acuosos; mientras que las proteínas y los lípidos se separan en solventes orgánicos (Sambrook et al. 1989). La fase acuosa y la orgánica se separan, lo que permite aislar al ADN.
Precipitación del ADN
Después de que son eliminados los lípidos y las proteínas se recupera el ADN. Para ello, se adiciona etanol y soluciones con altas concentraciones de iones de sodio o amonio que se unen a los grupos fosfato. Esta mezcla reduce las fuerzas repulsivas entre las cadenas y permite que el ADN se pliegue sobre sí mismo haciéndolo insoluble. Un paso de centrifugación permite que el ADN permanezca en el fondo del tubo o pegado a las bolas magnéticas mientras que el etanol es desechado. Los restos de etanol se eliminan con un lavado con etanol al 70 % y el remanente se elimina por evaporación.
Análisis previo al tratamiento
Dentro del tratamiento a diversas enfermedades y desórdenes en el cuerpo humano se debe realizar un respectivo estudio y análisis previo que permita identificar los causantes y el posterior tratamiento a seguir. Por esta razón se hace necesario que el profesional de la salud tenga pleno conocimiento en las diferentes técnicas que son utilizadas como herramienta para ello. Esta información es recopilada y dominada en su mayor parte mediante una especialización profesional.
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