Técnicas de biología molecular

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Las diferentes técnicas de biología molecular parten desde el objeto de estudio del diagnóstico molecular, en el laboratorio de microbiología. Estos son los ácidos nucleicos de los microorganismos reunidos en conjunto. Sus características principales pueden bien nombrarse así:

• La detección de los ácidos nucléicos no depende del crecimiento de los microorganismos lo que permite acortar mucho el tiempo en el resultado diagnóstico.
• El estudio del ADN y ARN permite identificar y cuantificar microorganismos abordando estos temas desde distintas soluciones técnicas. Entre ellas, las más populares son la PCR (Polimerase Chain Reaction), la prueba del ADN ramificado (bDNA) y el NASBA (Nucleic Acid Sequence Based Amplification).
• Aunque se pueden aplicar para cualquier microorganismo son especialmente útiles en caso de sospecha de bacterias de crecimiento lento o imposible (Legionella pneumophila, Borrelia burgdorferi, Chlamydia trachomatis, Bartonella henselae, entre otras), virus (familia herpes, adenovirus, enterovirus, papilomavirus, HCV, HBV, HIV) y algunos hongos y protozoos (Toxoplasma gondii).
• En general la diana de estas técnicas se trata de regiones conservadas como la 16S ARN para la identificación genérica de bacterias, y las regiones ITS (Internal Target Spacier) para los hongos, siendo más concretas y específicas para los virus.

Técnicas basadas en ácidos nucléicos (tban)

PCR

• Fue la primera técnica molecular introducida en los laboratorios de microbiología clínica.
• Consiste en la repetición de tres pasos fundamentales que se llevan a cabo a distintas temperaturas:
  • Desnaturalización del ADN molde. » Hibridación de los oligonucleótidos iniciadores o cebadores.
  • Polimerización mediante adición de los eslabones de la cadena, los desoxinucleótidos adenina, citosina, guanina, y timina.

Estos pasos se repiten “n” veces, consiguiéndose, desde el punto de vista teórico 2n copias por cada hebra original. Se trata de una amplificación geonómica, ya que se multiplica la cantidad del material original en cada ciclo.

Técnica del ADN ramificado (bDNA)

• Consiste en:
  • La retención del ácido nucléico objeto de estudio por varias sondas, fijadas al pocillo, que se unen a lo largo de la secuencia del mismo.
  • Una vez retenido se hibrida otro grupo de sondas que se unen a lo largo del ácido nucléico retenido.
  • Esas sondas tienen un fragmento común que dejan expuesto para que se una un ADN ramificado que se hibrida a cada una de ellas.
  • A su vez, este ADN ramificado es hibridado con multitud de sondas conjugadas con un enzima (fosfatasa alcalina) cuyo sustrato es quimioluminiscente.
• La cantidad de material génico es la original, lo que tiene lugar es un aumento de la señal de detección.

NASBA

Técnica de amplificación cuyo ácido nucleico de partida es el ARN, en lugar del ADN.

• Es una reacción isotérmica, a diferencia de la PCR.
• La mezcla de reacción contiene:
  • Oligonucleótidos cebadores.
  • Transcriptasa inversa, que retrotranscribe el ARN a ADN.
  • RNasa H, que elimina el ARN de los híbridos ARN-ADN, con lo que se obtiene una copia de ADN de la original de ARN.
  • T7 RNA polimerasa, que copia el ADN molde en versión ARN a partir de los precursores nucleotídicos.
• De manera que, cada una de las múltiples moléculas de ARN obtenidas en el proceso anterior sirve de molde para comenzar otra vez desde el principio.

Consideraciones técnicas y prácticas de la tban

Cuando se trabaja con este tipo de técnicas, es importante la precaución en el trabajo de la muestra clínica. En principio, se puede utilizar cualquier muestra clínica, como para cualquier otra técnica de microbiología, obviamente teniendo mucho cuidado en evitar contaminaciones.

• Hay que tener en cuenta que la sangre total se puede tomar en tubos que tengan cualquier anticoagulante excepto heparina de litio, ya que este componente inhibe la ADN polimerasa. Si no se van a trabajar las muestras en el momento de la recogida, se han de congelar entre -20 °C y – 85  °C en las 2 horas siguientes de su toma, evitando, en la manera de lo posible, su congelación y descongelación.
• La primera manipulación es la extracción del ADN. Se trata de liberar el ácido nucleico de las membranas que lo contienen, mediante lisis, separación del ácido nucleico, lavado y concentración.
• Para las técnicas PCR solo se puede partir de ADN, ya que las polimerasas utilizadas son ADN polimerasas ADN dependientes, por lo que para amplificar un ARN, previamente hay que hacer una transcripción inversa.
• Una vez amplificado el material genético se tiene que visualizar, para ello se puede usar la electroforesis en agarosa o en poliacrilamida; o bien hibridar los amplificados mediante técnicas de dot blot, southernbot o placa de microtitulación.

Cada vez más la tecnología introduce nuevos avances en el campo de la microbiología, siendo la biología molecular con sus TBAN una de las disciplinas que más destaca en este aspecto. En los últimos años, principalmente, se han introducido dos técnicas que tímidamente han mejorado mucho la microbiología molecular. Se trata de la PCR en tiempo real y de las micromatrices, también conocidas como microarrays o microchips.

PCR en tiempo real (RT-PCR)

• Se puede hacer de modo inespecífico (añadiendo el colorante SYBR), o, de modo más específico utilizando sondas de hibridación o de hidrólisis (sondas taqman).
• Consiste en una PCR clásica en la que en cada ciclo de PCR se detecta el ADN obtenido en ese momento.
• Se basa en la aplicación de la Tm (melting temperature) temperatura de fusión que es característica de un determinado fragmento de ácido nucleico, ya que depende de su tamaño y composición.

Tiene varias aplicaciones:

• Cuantificación, la más conocida, que se puede llevar a cabo con distintos tipos de sondas. » Identificación de mutaciones concretas, conocidas por SNPs (single nucleotide polymorphism).
• Genotipado e identificación de distintas especies microbianas.
• Tiene limitaciones, dependiendo de los canales del termociclador, la cantidad de genotipos y/o especies que se pueden identificar al mismo tiempo en cada ensayo. » A mayor número de canales más cantidad de genotipos y/o especies identificadas en un mismo ensayo.
• En la actualidad el número de canales máximo de los termocicladores que hay en el mercado es de seis.
• Este combinado con una PCR múltiple y la aplicación de la Tm puede distinguir un número reducido de genotipos o especies distintas en un solo ensayo. Por tanto, y en resumen, la RT-PCR es útil para cuantificar microorganismos, y para la identificación simultánea de genotipos y especies distintas, siempre que no se trate de un número elevado de ellas, o que existiendo muchas haya un grupo reducido de interés diagnóstico. Sería útil en el genotipado del virus de la hepatitis C, seleccionando los tipos o subtipos más interesantes.

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